肝细胞癌是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率高且预后差，尤其对于晚期患者而言治疗选择有限。乐伐替尼作为一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已被批准作为肝细胞癌的一线治疗药物，在临床应用中显示出优于索拉非尼的总体生存率和无进展生存率，但其具体分子机制尚未完全阐明。RRP15是一种核糖体RNA加工蛋白，在肝细胞癌中表达上调并与不良预后相关，前期研究表明抑制RRP15可通过诱导细胞衰老和凋亡来抑制肝细胞癌的进展，然而RRP15在调节肝细胞癌对乐伐替尼治疗反应中的作用仍不清楚。蛋白质降解是维持细胞稳态的核心过程，其中泛素-蛋白酶体途径在调控关键细胞过程中发挥重要作用，因此探索乐伐替尼是否通过调控蛋白质降解途径影响RRP15稳定性，对于理解其抗肿瘤机制具有重要意义。

本研究采用多种实验方法系统探讨了RRP15表达与乐伐替尼敏感性之间的关系及其潜在机制。实验使用人肝细胞癌细胞系Huh7、PLC/PRF/5和H22进行体外研究，这些细胞在含10%胎牛血清的DMEM或1640培养基中培养。通过Western blot和免疫组织化学检测RRP15和KBTBD8的表达水平，使用CCK-8法和克隆形成实验评估细胞活力和增殖能力，Transwell实验分析细胞迁移和侵袭，TUNEL和Annexin V染色通过流式细胞术检测细胞凋亡。为研究蛋白质相互作用，采用免疫共沉淀和质谱分析鉴定RRP15与KBTBD8的结合，并通过免疫荧光验证其共定位。为探究蛋白质降解机制，使用环己酰亚胺处理评估蛋白质稳定性，MG132处理验证蛋白酶体途径的参与，并通过体外泛素化实验分析RRP15的泛素化修饰。基因操作方面，利用慢病毒载体构建RRP15敲低和过表达的细胞模型，通过siRNA转染敲低KBTBD8、ATG5和ATG7表达，同时使用质粒转染实现KBTBD8和泛素结合酶UBC的过表达。体内实验部分，通过尾静脉注射H22细胞建立肺转移模型，小鼠随机分为乐伐替尼治疗组和对照组，乐伐替尼以10 mg/kg剂量每日口服给药，两周后收集肺组织进行组织学分析和蛋白质表达检测。所有实验均独立重复三次，数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，p值小于0.05认为具有显著性。

研究结果首先证实了RRP15在调节肝细胞癌对乐伐替尼敏感性中的关键作用。在PLC5细胞中敲低RRP15表达后，乐伐替尼诱导的细胞死亡和凋亡显著增强，而在Huh7细胞中过表达RRP15则减弱了乐伐替尼的促凋亡效应。克隆形成实验显示RRP15抑制增强了乐伐替尼对肝细胞癌细胞增殖的抑制作用，而过表达RRP15则逆转了这一效应。在细胞迁移和侵袭方面，RRP15敲低联合乐伐替尼处理显著抑制了肝细胞癌细胞的转移能力，Western blot分析进一步证实RRP15抑制可增强乐伐替尼对迁移相关蛋白表达的下调作用。接下来研究发现乐伐替尼以剂量依赖方式降低RRP15蛋白水平而不影响其mRNA表达，表明存在转录后调控机制。环己酰亚胺追踪实验显示乐伐替尼加速了RRP15的降解，而自噬抑制剂NH4Cl处理不影响RRP15降解，蛋白酶体抑制剂MG132则显著阻断这一过程，证明乐伐替尼通过泛素-蛋白酶体途径诱导RRP15降解。体外泛素化实验进一步证实乐伐替尼处理增加了RRP15的泛素化水平。

图1 RRP15对肝细胞癌乐伐替尼敏感性及细胞增殖和转移的调控

为鉴定介导RRP15降解的E3泛素连接酶，研究通过免疫共沉淀联合质谱分析发现KBTBD8与RRP15存在相互作用，免疫荧光显示两者在肝细胞癌细胞中显著共定位，免疫共沉淀实验进一步验证了这一相互作用。临床样本分析显示，与癌旁组织相比，肝细胞癌组织中KBTBD8表达下调而RRP15表达上调，两者表达呈负相关，生存分析表明KBTBD8高表达患者中位生存期显著延长。功能实验表明，KBTBD8敲低减弱了乐伐替尼对肝细胞癌细胞增殖和转移的抑制作用，而KBTBD8过表达则增强乐伐替尼的疗效。机制上，KBTBD8敲低延缓了乐伐替尼诱导的RRP15降解，而KBTBD8过表达增强了RRP15的泛素化，进一步研究发现乐伐替尼通过K11连接的多聚泛素链介导RRP15降解。回复实验显示，在过表达RRP15的肝细胞癌细胞中，同时过表达KBTBD8可逆转RRP15过表达引起的乐伐替尼耐药和增殖转移增强效应。体内实验结果表明，乐伐替尼治疗显著减少小鼠肺转移结节数量，免疫组化和Western blot分析显示乐伐替尼处理组肺组织中KBTBD8表达上调而RRP15表达下调，证实乐伐替尼在体内通过上调KBTBD8促进RRP15降解。

图2 乐伐替尼通过泛素-蛋白酶体途径诱导RRP15降解

总之，本研究系统阐明了乐伐替尼通过上调E3泛素连接酶KBTBD8表达，促进RRP15的K11连接泛素化修饰及蛋白酶体降解，从而抑制肝细胞癌细胞增殖和转移的分子机制。这一发现不仅揭示了乐伐替尼抗肿瘤作用的新机制，还首次将RRP15-KBTBD8轴确定为肝细胞癌治疗的潜在新靶点，为乐伐替尼的精准临床应用提供了理论依据。研究也存在一定局限性，如动物实验仅聚焦肺转移模型，未来需利用条件性基因敲除或转基因小鼠模型进一步验证RRP15和KBTBD8在肿瘤进展中的作用，并评估乐伐替尼在体内的治疗窗和安全性，以推动研究成果向临床转化。

原始出处：

Zhao, S., Wang, X., Wu, R., Wang, F., Tang, X., Chen, J., Jiang, R., Kang, W., Xu, G., Wang, L., Wang, Z., Zou, X., & Zhang, B. (2025). KBTBD8/RRP15 as a potential novel therapeutic target associates with lenvatinib-inhibited progression in hepatocellular carcinoma both in vitro and in vivo. Journal of Advanced Research, 76, 569-583. https://doi.org/10.1016/j.jare.2024.12.017

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Tags： Journal of Advanced Research：KBTBD8/RRP15作为潜在的新型治疗靶点与乐伐替尼抑制肝细胞癌进展相关