摘要:巨噬细胞与急性缺血性卒中的关系是目前研究的热点｡研究表明,中枢神经系统､血管壁及循环系统中的巨噬细胞可通过加重炎症反应､发挥吞噬作用或诱导血管内皮细胞铁死亡等不同机制对急性缺血性卒中的病情进展产生影响,且血管壁及循环系统中的巨噬细胞可通过外泌体在急性缺血性卒中发生过程中发挥重要作用｡该文对巨噬细胞在急性缺血性卒中中的作用机制进行了综述,以期为深入研究巨噬细胞与急性缺血性卒中的关系进而制定精准治疗方案提供参考｡

卒中是全球第二大死亡病因及第三大致残病因,且患病率逐年增加｡我国缺血性卒中人数占卒中总人数的80%以上｡静脉溶栓和机械取栓提高了急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者的血管成功再通率,但仍有部分患者预后不良｡因此,深入探索AIS的损伤机制对改善AIS患者预后至关重要｡研究表明,免疫细胞(如单核细胞､中性粒细胞､巨噬细胞等)在AIS的病理生理学机制中发挥着重要作用,其中巨噬细胞尤为重要｡单细胞测序技术检测结果显示,巨噬细胞存在多种功能亚型,包括过渡态､低氧适应态和脂质代谢态,各功能亚型的基因表达呈现梯度变化,提示巨噬细胞的功能具有连续性与动态可塑性,这打破了传统的巨噬细胞M1､M2型二分法｡但目前尚缺乏巨噬细胞各功能亚型与AIS发生发展之间关系的研究,故本文中涉及巨噬细胞分型时仍沿用传统的M1､M2型二分法｡笔者从信号分子变化层面对中枢神经系统､血管壁及循环系统中的巨噬细胞在AIS中的作用机制进行综述,旨在为AIS相关研究及治疗提供思路｡

1 中枢神经系统中的巨噬细胞与AIS

与外周血中的巨噬细胞来源于骨髓单核细胞不同,中枢神经系统中的常驻巨噬细胞———小胶质细胞来源于胚胎早期卵黄囊｡AIS急性期小胶质细胞是最早被激活的细胞之一｡在AIS发生后即刻,由于脑血流量急剧下降,脑组织缺血缺氧,为满足低氧状态下各种促炎因子合成所需的能量,小胶质细胞与外周血中的巨噬细胞的胞内糖代谢途径由正常生理状态下的氧化磷酸化转变为糖酵解途径,并转化为促炎表型M1型小胶质细胞,分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)､白细胞介素6､活性氧等物质,产生神经毒性;随着AIS病情的进展,巨噬细胞向抗炎表型M2型小胶质细胞转化,M2型小胶质细胞可通过分泌抗炎因子及神经营养因子等发挥神经保护作用｡目前,针对小胶质细胞与AIS之间关系的研究较多,包括不同部位(梗死核心区､缺血半暗带)､不同亚型(M1､M2型)小胶质细胞对AIS的影响,以及小胶质细胞与神经元通讯模式(如直接接触､外泌体､信号因子)､外周免疫细胞(如中性粒细胞)相互作用对AIS的影响｡但是关于高血压条件下小胶质细胞影响AIS相关机制的临床研究相对缺乏｡有研究显示,与正常血压大鼠相比,自发性高血压大鼠缺血性卒中后3d的梗死体积更大(P<0.05),可能与高血压条件下小胶质细胞激活加重炎症反应有关,但具体机制尚不明确｡

纹状体富集酪氨酸磷酸酶61(striatal enriched tyrosine phosphatase 61, STEP61)是STEP家族中的重要亚型,研究表明,STEP可与神经元中细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase, ERK/MAPK)结合,使其去磷酸化失去活性,激活下游信号通路,从而保护神经细胞｡核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)是一种具有诱导活性的转录因子,存在于大多数细胞中,研究表明,NF-κB在神经细胞存活､炎症反应和癌症进展等的调节过程中均发挥着关键作用｡大脑中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平升高可促使中枢神经系统中的小胶质细胞向促炎表型M1型加速转化,该表型形态上表现为分支减少､面积缩小､周长减低｡促炎表型M1型小胶质细胞高表达跨膜糖蛋白CD68和TNF-α,CD68高表达表明小胶质细胞吞噬活性增强,且TNF-α高表达可维持小胶质细胞的促炎活性｡一项研究构建了自发性高血压AIS(实验组)和正常血压AIS(对照组)大鼠模型,免疫印迹分析结果显示,与对照组比较,实验组大鼠STEP61蛋白二聚化水平升高(P<0.01),二聚化STEP61蛋白活性降低(P<0.01),且其底物ERK/MAPK表达高于对照组大鼠(P<0.01);逆转录聚合酶链反应检测结果显示,实验组大鼠NF-κB信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)及NF-κB靶基因环氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)mRNA表达较对照组大鼠均上调(均P<0.05);酶免疫分析显示,实验组大鼠脑组织PGE2表达较对照组大鼠升高(P<0.01);逆转录聚合酶链反应检测结果显示,实验组大鼠小胶质细胞CD68 mRNA､TNF-α mRNA表达水平均高于对照组大鼠(均P<0.01);静脉注射STEP模拟肽的高血压AIS大鼠的CD68 mRNA和TNF-α mRNA表达水平均低于未处理组高血压AIS大鼠(均P<0.01),且脑梗死体积缩小(P<0.01)｡以上研究提示高血压状态下AIS大鼠可能通过抑制STEP活性激活ERK/MAPK/NF-κB信号通路,诱导小胶质细胞向促炎表型M1型转化,加剧脑缺血后的神经炎症反应｡同时,STEP模拟肽可减轻AIS神经炎症､缩小脑梗死体积,提示未来研究或可关注阻断STEP/ERK/MAPK/NF-κB信号通路各靶点,从而减轻AIS急性期神经炎症反应｡

2 血管壁中的巨噬细胞与AIS

聚集在动脉内膜下的巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质后会导致细胞形态发生改变,形成泡沫细胞,其为动脉粥样硬化斑块形成和发展过程中的核心参与者｡在动脉粥样硬化斑块形成过程中,内皮细胞､免疫细胞､平滑肌细胞和泡沫细胞均可分泌外泌体｡外泌体为细胞释放至细胞外液中的纳米大小､包裹在磷脂双分子层中的细胞外囊泡,为细胞间通讯的载体,可穿越血-脑屏障与特定受体结合并释放其内的物质如DNA､RNA､脂质､代谢物以及胞质和细胞表面蛋白等来诱导受体细胞发生生理变化｡外泌体中富含非编码RNA,这些非编码RNA虽然不能直接参与基因转录,但可以在转录后加工并在染色质修饰水平上调节基因表达｡但泡沫细胞参与AIS发生､发展的具体机制尚不明确｡

近期一项实验结果显示,巨噬细胞来源的泡沫细胞分泌的外泌体中的微小RNA(micro RNA,miR)-30c-2-3p可能与AIS有关,该研究采用免疫荧光染色分析了人血浆､动脉粥样硬化斑块及小鼠血浆､动脉粥样硬化斑块,结果显示,高miR-30c-2-3p表达的血浆外泌体可能来源于动脉粥样硬化斑块组织中的泡沫细胞;进一步分析AIS小鼠脑组织细胞及体外培养细胞,结果显示,AIS发生后,高miR-30c-2-3p表达的血浆外泌体可能被大脑中的小胶质细胞摄取并促进小胶质细胞向促炎表型转化,加重神经炎症并增大AIS小鼠脑梗死体积;研究者通过双荧光素酶实验分析体外培养细胞以探索泡沫细胞来源的外泌体中的miR-30c-2-3p影响小胶质细胞的机制,结果显示,miR-30c-2-3p可与Smad2蛋白mRNA的3′UTR结合并降低Smad2蛋白水平(P=0.0123),进一步将miR-30c-2-3p模拟物和Smad2干扰RNA(si-Smad2 RNA)分别转染至小胶质细胞中,结果显示,与未进行任何转染的小胶质细胞相比,前两者小胶质细胞中的促炎因子白细胞介素6和TNF-α的表达水平均升高(均P<0.05),而抗炎因子精氨酸酶1和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的表达水平均降低(均P<0.05),且共转染miR-30c-2-3p模拟物与si-Smad2 RNA后,小胶质细胞的促炎效应消失,提示miR-30c-2-3p可能通过抑制Smad2调控小胶质细胞表型转化;此外,在脱氧小胶质细胞中,转染miR-30c-2-3p模拟物降低了Smad2蛋白表达水平及其磷酸化水平(均P<0.05),si-Smad2 RNA转染组Smad2蛋白表达水平及其磷酸化水平也降低(均P<0.05)｡miR-30c-2-3p是miR-30家族中的一员,属于miRNA,miRNA是一种非编码RNA｡Smad2是TGF-β信号通路中的关键蛋白,当其水平升高时,可激活TGF-β通路使小胶质细胞处于抗炎表型状态｡以上实验结果表明,当AIS发生时,动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞来源的泡沫细胞分泌的富含miR-30c-2-3p的外泌体可穿过血-脑屏障,并与中枢神经系统中的小胶质细胞结合加重AIS后神经炎症｡未来可进一步探索Smad2的下游分子机制,完善泡沫细胞来源外泌体中的miR-30c-2-3p影响TGF-β和Smad2在动脉粥样硬化性缺血性卒中中的分子机制,为AIS外泌体精准治疗提供依据｡

目前,外泌体因其免疫原性低､稳定性好､递送效率高､能穿过血-脑屏障的特点,已成为治疗AIS的研究热点｡有研究指出,将氧化铁纳米颗粒加载至外泌体中,在外部磁场条件下将磁性纳米囊泡引导入大脑中有利于提高治疗性外泌体的递送效率,并延长其在靶器官内的保留时间｡未来研究可将Smad2模拟物与含氧化铁纳米颗粒的外泌体相结合,通过磁场将其输送至AIS患者梗死区域,从而激活Smad2和TGF-β信号通路,达到减轻神经炎症､缩小AIS梗死体积的目的｡

3 循环系统中的巨噬细胞与AIS

早期恢复缺血区域的血流,挽救缺血半暗带是治疗AIS的主要方法｡然而,再灌注可诱发脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)｡

血小板凝血酶蛋白1(thrombospondin 1,THBS1)是一种抗血管生成因子,其可以介导细胞间通讯,调节细胞功能,机体受到损伤或应激刺激时会导致其过度表达｡OTUD5作为一种半胱氨酸蛋白酶,是OTU去泛素酶家族的关键成员,其能够逆转蛋白质泛素化修饰,从而调节细胞活动｡谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)是铁死亡的关键调节因子,可有效抑制脂质氧化,影响细胞衰老､肿瘤发生和细胞死亡,在抗氧化剂谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的作用下GPX4可将潜在有毒的脂质氢过氧化物转化为无毒的脂质醇,从而保护磷脂酰胆碱脂质体和生物膜被过氧化降解｡有研究显示,THBS1与内皮细胞中的OTUD5相互作用可导致内皮细胞中的GPX4泛素化增加,该研究将GPX4特异性敲除的短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型小鼠作为实验组,以未敲除GPX4的tMCAO模型小鼠作为对照组,结果显示,与对照组比较,实验组tMCAO小鼠脑组织中伊文思蓝染色浓度升高(P=0.0001),紧密连接蛋白ZO-1(P=0.0155)､Occludin(P=0.0155)､Claudin-5(P= 0.0053)表达水平降低,提示GPX4特异性敲除tMCAO小鼠的血-脑屏障被破坏;与未沉默THBS1 tMCAO小鼠相比,沉默THBS1 tMCAO小鼠脑组织中伊文思蓝染色浓度降低(P=0.0010),表明沉默THBS1后tMCAO小鼠血-脑屏障通透性部分恢复;研究者进一步将经过氧糖剥夺-复氧处理的巨噬细胞作为CIRI后AIS相关巨噬细胞,检测其外泌体共培养的人脑微血管内皮细胞中GPX4的泛素化水平,结果显示,AIS相关巨噬细胞外泌体中的GPX4泛素化水平较正常巨噬细胞外泌体升高(P=0.0021),敲低THBS1后该现象明显减弱(P=0.0362),免疫共沉淀结果显示,THBS1可与去泛素化酶OTUD5直接结合,进一步沉默与敲低THBS1与巨噬细胞外泌体共培养的内皮细胞中的OTUD5后,GPX4泛素化水平增加(P<0.05),表明在CIRI中,巨噬细胞来源的外泌体中的THBS1通过调节OTUD5活性影响内皮细胞中的GPX4泛素化水平;而丹酚酸B可抑制THBS1与OTUD5的结合,降低GPX4泛素化水平(P<0.01),提示CIRI发生时巨噬细胞外泌体中THBS1通过THBS1/ OTUD5GPX4轴使GPX4泛素化水平降低,导致脑血管内皮脂质代谢紊乱｡

细胞铁死亡是一种程序性､铁依赖性非凋亡细胞死亡形式,其形态学､生化和遗传学与细胞凋亡､坏死和自噬不同,核心机制是铁依赖的脂质过氧化,其调控网络包含铁代谢､脂质代谢､抗氧化防御等多条代谢通路｡研究表明,丹酚酸B可与THBS1结合并抑制其作用,从而降低脑血管内皮细胞铁死亡率｡由于外泌体能够穿过血-脑屏障,未来研究或可将丹酚酸B与普通巨噬细胞外泌体结合从而为CIRI的精准治疗提供思路｡星形胶质细胞中的THBS1有助于神经元中的突触重塑,促进CIRI亚急性期和慢性期的神经元修复,因此,未来深入研究CIRI急性期抑制THBS1减轻神经元损伤,亚急性期和慢性期保留THBS1促进神经元修复的可行性,或可为CIRI的精准治疗提供依据｡此外,有研究显示,AIS患者血浆外泌体中的THBS1水平与血-脑屏障损伤标志物基质金属蛋白酶9水平成正相关,基质金属蛋白酶9是一组锌依赖性内肽酶,可降解细胞外或神经血管基质的元素,导致神经血管损伤｡未来可进一步探索THBS1与基质金属蛋白酶9是否存在协同关系｡

此外,AIS患者可能发生肠道菌群失调和肠道屏障损伤,且其胃肠道出血风险增加｡有研究指出,肠道菌群产生的短链脂肪酸可通过调节巨噬细胞的基因表达抑制促炎因子的分泌,促进抗炎因子的产生,使巨噬细胞从促炎表型M1型向抗炎表型M2型转化,并改变巨噬细胞代谢模式,如抑制糖酵解､增强氧化磷酸化｡未来深入探索肠道菌群产生的短链脂肪酸与AIS相关巨噬细胞的关系,可为AIS治疗提供依据｡

4 小结

综上所述,巨噬细胞可能通过炎症调控､外泌体介导的细胞间通讯等机制,在AIS发生､发展和CIRI中发挥关键作用｡针对STEP､miR-30c-2-3p､THBS1等靶点的AIS干预策略具有一定发展潜力,但需明确最佳治疗窗口期及下游分子机制,以促进临床转化｡此外,外泌体具有免疫原性低､稳定性好､递送效率高､可穿过血-脑屏障的优势,未来或可用于AIS的精准治疗,尤其是纳米技术与外泌体结合的AIS治疗有待于进一步探索｡

Tags： 【综述】巨噬细胞与急性缺血性卒中关系的分子机制研究进展