现在广泛使用的ABE（Adenine base editor，腺嘌呤碱基编辑器）和CBE（Cytosine base editor，胞嘧啶碱基编辑器）可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转换（transition；即嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶）。在CBE基础上开发出的CGBE或GBE（Glycosylase base editor，糖基化酶碱基编辑器）能实现C-to-G和C-to-A此类碱基之间的颠换（transversion；即嘧啶变嘌呤）。CGBE或GBE的开发得益于对CBE编辑副产物（包括 C-to-G 和 C-to-A的颠换）的深入研究，拓展了人们对DNA损伤修复机制的研究并拓宽了碱基编辑器的应用。

细胞中存在可以高效切除胞嘧啶脱氨产生的尿嘧啶（U）的酶（UNG，尿嘧啶DNA 糖基化酶），引入UNG或剔除CBE融合蛋白中的尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）组分都能通过生成无碱基（AP，apurinic/apyrimidinic site）中间体介导高效的C-to-G 和/或 C-to-A的碱基颠换。ABE的编辑副产物极少，是由于细胞中尚未发现能高效切除腺嘌呤脱氨形成的脱氧肌苷（I）中次黄嘌呤碱基（Hx）的酶，A脱氨形成的I直接被当作G读取，进而获得A-to-G的高纯度编辑。这也为开发AYBE增加了很大的困难。

 

研究团队发现N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG；也称烷基腺嘌呤DNA糖基化酶，AAG）有一定的切除Hx的活性，于是猜想可以通过工程化改造MPG逐步优化，开发出高效的AYBE。研究团队首先将MPG融合在ABE8e的不同位置构建了AYBE的三种原型版本。为了方便且灵敏地评估腺嘌呤碱基颠换的发生以及颠换编辑的效率，研究团队设计了一套基于内含子剪接可激活的荧光报告系统。

 

在该荧光报告系统中，只有发生了腺嘌呤碱基的颠换，才能纠正内含子剪接信号使剪接过程正确发生，进而激活绿色荧光蛋白（EGFP）的正常表达，以便结合流式细胞术检测绿色荧光阳性细胞的数目及荧光强度。研究团队利用A-to-T报告系统及A-to-C报告系统都检测到了腺嘌呤碱基的有效颠换编辑，并发现与另外两种融合原型相比，将野生型MPG融合在ABE8e的C端（TCM，称为AYBEv0.1）获得了最高比例的阳性编辑。

 

图1：AYBE的工程化设计、蛋白质进化、突变筛选及颠换编辑活性检测

 

为了提升AYBE的腺嘌呤颠换编辑活性，研究团队利用上述报告系统在哺乳动物细胞中对AYBE中的MPG组分开展了逐步的优化。研究人员设计了多种工程化改造方案，构建了一系列突变体库，经过多轮的突变筛选获得了腺嘌呤颠换编辑效率较高的突变体（图1）。利用报告系统评估，AYBEv3版本的腺嘌呤颠换编辑效率达到了初代版本AYBEv0.1的4.78倍，获得了非常显著的优化升级。各个突变体的颠换编辑效率在基因组内源位点上也得到了验证（A-to-T的编辑从 5.88%提高到了 15.49%，A-to-C的编辑从 14.42%提高到了 30.98%），而且AYBEv3有着与AYBEv0.1相当的低indels频率。

 

接下来，研究团队在基因组内的35个靶点对AYBEv3作了综合评估，发现其可实现高达72%的颠换编辑效率（其中个别位点A-to-C的颠换效率可达53%，纯度可达70%，图2）。AYBEv3在A7、A8这两个位置及CAA和CAG这两种基序有着最高的颠换编辑效率。另外，AYBEv3在多种哺乳动物细胞类型中都能有效的实现腺嘌呤的颠换编辑。通过对gRNA依赖的及gRNA非依赖的脱靶分析，研究团队发现与ABE8e相比，AYBEv3的DNA脱靶水平更低。该研究也进一步通过建立稳转细胞系探究了AYBEv3在一些疾病相关突变位点上的应用潜力。研究人员发现基因DMD和SLC26A4中提前终止密码子的突变及基因ATM和TTN中内含子剪接位点处的突变可以使用AYBEv3得到有效的纠正。

 

图2：AYBEv3在基因组内源位点上的性能评估及一种ATBE开发策略

 

在这项研究中，研究团队通过引入DNA损伤修复蛋白Polη（一种在跨损伤DNA复制过程中倾向于在AP中间体对侧添加A的DNA聚合酶），大大提高了A-to-T的编辑效率和纯度，为进一步开发更精准的ATBE或ACBE提供了新的策略（图2）。虽然AYBEv3的编辑效率及纯度仍需进一步提高，腺嘌呤颠换碱基编辑器的开发填补了目前碱基编辑器不能高效实现A-to-C或A-to-T的空白，对相关疾病模型的建立及基因治疗领域等都有着非常重要的意义。

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01595-6