三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及HER2表达，占乳腺癌约12-17%。TNBC快速增殖、耐药性强及高转移率等恶性特征，使得手术、放疗及化疗仍是主流疗法，但疗效有限，缺少针对性靶向分子。近年来，非编码RNA（ncRNA）证实可编码具有生物活性的微肽，成为肿瘤标志物和靶癌分子的宝库。c-Myc作为癌症重要驱动基因，在60%的TNBC中过度扩增，高表达关联差预后。c-Myc蛋白含GSK-3β磷酸化依赖的降解信号，认知E3泛素连接酶FBW7介导其泛素化降解，然而TNBC中c-Myc高表达机制不完全明确，且FBW7基因突变较少，提示存在调控缺口。

近期，发表于Signal Transduction and Targeted Therapy的一项研究，由中国科学院昆明动物研究所等单位联合完成，结果发现lncRNA CDKN2B-AS1通过非常规CUG起始密码子翻译出66氨基酸肽“66CTG”，能通过与E3泛素连接酶FBW7α亚型竞争性结合，阻止c-Myc降解，进而促进TNBC细胞的增殖及肿瘤体内生长。该机制深化了对c-Myc高表达来源的理解，同时为TNBC精准治疗提供创新靶点。

1. 发现并鉴定新肽66CTG的存在与表达

通过整合公开核糖体测序、TCGA数据库、ORFfinder与SmProt数据库，研究团队筛选出lncRNA CDKN2B-AS1编码的19个非AUG起始开放阅读框，重叠分析确定ORF1编码的非传统CUG起始、新型66氨基酸肽66CTG。构建带3×Flag标签的66CTG表达质粒，验证其可翻译表达。利用CRISPR-Cas9将3×HA标签敲入HEK293T及TNBC BT549细胞的66CTG基因终端，内源性蛋白表达被证实。质谱分析进一步确认BT549细胞中66CTG的天然表达。

2. 66CTG独立于CDKN2B-AS1促进TNBC细胞增殖

66CTG在TNBC多细胞系（MDA-MB-231、HCC1806）中的过表达显著促进细胞增殖（SRB法及克隆形成实验）。CRISPR-Cas9介导的起始密码子CTG突变为CCG导致肽表达丧失，并抑制BT549细胞增殖，显示66CTG功能独立于母体lncRNA。筛选高表达66CTG的BT549、MDA-MB-468细胞，通过特异siRNA沉默66CTG，均观察到细胞G1期阻滞及增殖减弱，确立其促进细胞周期进展的功能。

图. 66CTG促进TNBC细胞增殖

3. 66CTG促进细胞周期进展并上调Cyclin D1

66CTG缺失细胞中Cyclin D1蛋白显著下调，细胞周期分析显示G1阻滞，表明66CTG促进G1/S期转变。66CTG过表达细胞在饥饿应激下仍能继续向S期推进，并伴有Cyclin D1上调，提示其驱动细胞周期关键调控因子。

图. 66CTG调控细胞周期进程及Cyclin D1表达

4. 66CTG通过稳定c-Myc蛋白促进Cyclin D1转录

RT-qPCR显示66CTG敲低抑制CCND1转录，但不影响MYC转录水平。Western blot检测66CTG影响c-Myc蛋白表达呈正相关。c-Myc过表达可逆转66CTG敲低对Cyclin D1及细胞增殖的抑制，说明66CTG作用依赖于c-Myc。逆向实验中，c-Myc敲低亦促进G1阻滞，并下调66CTG蛋白，提示二者在蛋白水平互相稳定。MG132抑制剂介导的蛋白酶体抑制表明66CTG延长c-Myc蛋白半衰期。细胞同步实验中，66CTG主要位于核内，且与c-Myc及Cyclin D1表达动态相符，进一步强化其调控链路。

图. 66CTG通过稳定c-Myc调控Cyclin D1及细胞增殖

5. 66CTG促进TNBC异种移植瘤生长并提升c-Myc/Cyclin D1表达

MDA-MB-231-Luc细胞稳定过表达66CTG或突变66ATG构建异种移植瘤模型。实时成像及肿瘤体积/重量测量显示66CTG显著促进肿瘤生长，伴肿瘤组织c-Myc和Cyclin D1蛋白水平升高。反向实验中，MDA-MB-468稳定敲低66CTG，肿瘤生长受抑制，c-Myc及Cyclin D1表达下降。临床TNBC组织样本免疫组化分析发现66CTG、c-Myc、Cyclin D1表达高度共表达且相互正相关。

图. 66CTG促进TNBC肿瘤生长及c-Myc/Cyclin D1表达

6. 66CTG及c-Myc在G1期受到SCF^FBW7α介导的泛素降解调控

利用血清饥饿诱导G1阻滞，MG132抑制剂处理后66CTG与c-Myc表达下降趋势被逆转，提示66CTG经历泛素-蛋白酶体途径降解。RNA干扰筛查核心SCF泛素连接酶组分发现，CUL1及FBW7敲低逆转66CTG和c-Myc蛋白降解。Cyclin D1在该调控网络中无明显改变。CHX追踪降解半衰期进一步证明FBW7影响66CTG和c-Myc蛋白稳定性。

图. FBW7介导66CTG及c-Myc蛋白的降解

7. 66CTG通过竞争结合FBW7α亚型稳定c-Myc蛋白

FBW7在核内主要存在三种亚型（α、β、γ），仅核内α亚型能有效促进66CTG及c-Myc降解。免疫共沉淀结果显示66CTG与FBW7α/β均结合，但β亚型主要位于细胞质，解释其不能促进降解。过表达66CTG减少FBW7α与c-Myc相互作用，降低c-Myc泛素化，证明其竞争结合机制。c-Myc过表达同样弱化FBW7α与66CTG结合，体现双向保护机制，共同稳定蛋白水平。

图 66CTG与c-Myc竞争结合FBW7α，阻止其泛素化降解

8. FBW7α通过识别66CTG的CPD S56/S60磷酸化位点介导泛素化降解

66CTG含三个可能的FBW7识别磷酸化降解信号（CPD）位点，突变S56/S60使其对FBW7α结合及泛素化耐受，蛋白稳定性增强但失去稳定c-Myc的功能。进一步敲低GSK-3β或应用其抑制剂LiCl抑制磷酸化，阻断66CTG降解。提示GSK-3β介导的磷酸化修饰是FBW7介导降解机制的关键。

图 FBW7α识别GSK-3β磷酸化位点介导66CTG泛素化降解

总之，该研究突破了非AUG起始密码子编码微肽的研究瓶颈，鉴定了由lncRNA CDKN2B-AS1编码的66CTG肽，其在TNBC中作为新型致癌因子参与调控c-Myc蛋白稳态。66CTG通过拮抗FBW7α对c-Myc的泛素化降解，强化c-Myc/Cyclin D1轴活性，驱动TNBC细胞周期进展与恶性生长。此机制填补了TNBC中c-Myc高表达但FBW7突变率低的调控空白，展现调控蛋白-泛素酶相互作用的复杂层级。66CTG在临床样本中高度表达且与经典致瘤因子正相关，为精准诊疗提供了新思路。相较于直接靶向c-Myc带来的系统毒性，靶向66CTG有望提高治疗特异性，降低副作用。此外，该发现揭示了ncRNA编码小肽在肿瘤进展中的重要作用，烘托出深入挖掘ncRNA编码组分及其相互作用网络的新兴研究方向。未来研究可围绕66CTG结构功能关系、肽介导的特异性药物设计、及其在其他癌种的表达作用探讨，推动更有效的靶向策略。

原始出处：

Liang H, Li F, Fang H, et al. A novel peptide 66CTG stabilizes Myc proto-oncogene protein to promote triple-negative breast cancer growth. Signal Transduct Target Ther. 2025;10:217.

Tags： STTT：新型小肽66CTG稳定c-Myc蛋白，促进三阴性乳腺癌进展