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乳腺癌治疗为什么总会面临“复发”和“耐药”这两大难题？越来越多研究发现，真正“顽固”的并不是肿瘤中数量最多的癌细胞，而是一小群具有干细胞特性的癌症干细胞（csc）。它们就像肿瘤中的“种子”，能够不断自我更新，并驱动肿瘤生长、转移和治疗抵抗。然而，如何从患者极少量的临床样本中快速、高效地分离出这些癌症干细胞，并在短时间内完成药物敏感性测试，一直是精准医学领域的重要瓶颈。

近日，中科院苏州纳米所索广力研究员、Zhongjuan Xu联合苏州大学第一附属医院周好教授开发出一种基于微孔芯片（MWC-chip）的高通量培养平台，可在仅约50 mg乳腺癌活检组织的基础上，于5天内快速生成数千个来源于患者的微型肿瘤球（MTSs），并在8天内完成个体化药敏测试。研究表明，这些微型肿瘤球不仅高度富集癌症干细胞，还能真实保留患者肿瘤的异质性与临床特征，对乳腺癌患者治疗结局的预测准确率高达93.8%。这一成果意味着，未来医生或许能够在患者正式接受治疗前，就提前“试药”，找到最有效的治疗方案。相关成果以“High-throughput generation of patient-derived cancer stem cells for precision medicine using a microwell-chip platform”为题发表在《Nature Cell Biology》上，第一作者为Zhe Zhao。

研究首先展示了整个MWC-chip平台的设计逻辑与运行流程（图1a）。研究团队利用软光刻技术，在一个仅2×2 cm大小的芯片上构建了约15000个微孔阵列，每个微孔直径约80 μm，能够容纳约100个肿瘤细胞（图1b）。由于乳腺癌中的癌症干细胞通常不足总细胞数的1%，因此这种设计能够最大程度保证“一个微孔中最多只有一个CSC”，从而实现单个癌症干细胞的克隆扩增。整个实验流程也十分紧凑（图1c）。研究人员从患者手术或穿刺活检获得乳腺癌组织（图1d），随后将组织消化成单细胞，再铺到微孔芯片中培养。最开始的2天采用“选择培养基”，通过低黏附和营养压力条件淘汰普通癌细胞，仅让耐受能力更强的CSC存活；随后再切换至生长培养基，让这些CSC继续扩增形成微型肿瘤球（图1e）。令人惊讶的是，仅需约50 mg组织，5天内即可获得5000~12000个均一化MTSs。

研究人员进一步统计发现，肿瘤组织形成MTSs的能力远高于癌旁组织（图1h、1i）。这些MTSs大小均一，大多直径在30~75 μm之间，每个肿瘤球大约包含5~15个细胞（图1j、1k）。在262位乳腺癌患者共265份样本中，无论是穿刺活检还是手术组织，MTSs的成功构建率都超过90%（图1l）。而且，三阴性乳腺癌（TNBC）以及接受过新辅助治疗的患者，其MTS形成率明显更高（图1m-1o），暗示这类恶性程度更高、耐药性更强的肿瘤，往往含有更多CSC。

图1：微孔芯片平台实现患者来源乳腺癌微型肿瘤球（MTSs）的高通量快速构建。

接下来，研究团队重点验证：这些MTSs究竟是不是真正来源于癌症干细胞？首先，他们通过EdU实验发现，MTSs中的细胞具有持续而强烈的增殖能力（图2a）。随后，研究人员把红色和绿色标记的肿瘤细胞混合培养，如果一个肿瘤球来源于多个细胞，那么最终应呈现黄色混合信号；而实验结果显示，超过91%的MTSs只呈现单一颜色（图2b、2c），说明绝大多数MTSs都来自单个细胞的克隆扩增。更关键的是，这些MTSs展现出典型的“干性”特征。与普通残余细胞相比，MTS来源细胞在Matrigel和软琼脂中形成克隆的能力分别提高了3.2倍和4.8倍（图2e-2h）。单个MTS甚至可以持续增殖16天（图2i）。免疫荧光检测发现，CD44和ALDH1A1等经典乳腺癌干细胞标志物在MTSs中高度表达（图2j）。随后，研究人员在70位患者样本中进行qPCR检测，也发现MTSs中的干性相关基因显著高于普通肿瘤细胞（图2k）。不仅如此，研究团队还发现，这些MTSs拥有更强的成瘤能力。在小鼠移植实验中，仅需极少量MTS来源细胞，就能形成明显肿瘤（图2o）。而普通肿瘤细胞则需要更高剂量才能实现同样效果。这说明，MTSs确实富集了具有自我更新和肿瘤起始能力的CSC。

图2：MTSs来源于单个癌症干细胞，具有强增殖、自我更新和高成瘤能力。

为了更精确评估CSC比例，研究团队建立了一种“极限稀释分析”体系（图3a-3c）。他们设计了不同尺寸的微孔芯片，通过逐渐减少每个孔中的细胞数量，反推出CSC频率（图3d）。结果显示，不同患者之间CSC比例差异巨大：部分患者CSC比例仅约0.5%，而另一些则接近2%（图3e-3g）。尤其值得注意的是，当MTS形成率超过70%时，往往意味着CSC比例超过1%。但在246例临床样本中，超过90%的患者CSC比例都低于1%（图3h）。这再次说明，真正决定肿瘤恶性的，可能正是这极少数“种子细胞”。

图3：研究团队建立极限稀释分析体系，用于定量评估患者肿瘤中的癌症干细胞比例

随后，研究人员进一步利用单细胞RNA测序技术，探索这些MTSs是否能够真实反映患者肿瘤的异质性（图4a）。研究发现，MTSs中的98%以上细胞都属于上皮/癌细胞，而原始肿瘤组织中这一比例仅约20%（图4b、4c）。与此同时，MTSs中富集了大量高表达CD44、c-MYC、HES1等干性基因的细胞亚群（图4f-4h）。更有意思的是，研究团队通过拟时序分析发现，MTS中的细胞位于肿瘤演化轨迹的“起点”（图4i、4j），而成熟肿瘤细胞则位于后期阶段。这意味着，MTSs不仅仅是肿瘤的一个“缩小版”，更像是肿瘤发展的“源头模型”，能够帮助研究人员观察肿瘤最初发生和演变的过程。不过，研究人员也注意到，如果长期传代培养，MTSs的细胞组成会逐渐发生改变（图4k-4m）。虽然干性仍然存在，但原始肿瘤异质性会逐渐丢失。这意味着，早期代次的MTSs更适合用于精准医疗和药物测试。

图4：单细胞测序证明MTSs能够真实保留乳腺癌干细胞的异质性与早期肿瘤特征

在模型均一性方面，研究团队将MTSs与传统患者来源类器官（PDOs）进行了对比（图5a）。传统PDOs通常含有大量基质细胞和免疫细胞，而MTSs则几乎完全由癌症干细胞组成（图5b、5c）。更重要的是，不同MTS之间的基因表达高度一致（图5d、5e），远优于PDOs。这种均一性意味着，在药物测试中，实验结果会更加稳定、重复性更高。

图5：相比传统类器官，MTSs具有更高均一性和更稳定的干细胞特征。

随后，研究进入最关键的部分：个体化药敏测试（图6a）。研究团队发现，MTSs相比普通肿瘤细胞，对多种化疗药物都表现出更强耐药性（图6d-6f）。换句话说，如果一种药物能够有效杀死MTSs，那么它更有可能真正消灭导致复发的“根源”。为了建立临床预测体系，研究人员设置了一个“70%存活率阈值”：如果药物处理后MTSs存活率低于70%，则判定患者可能对该方案敏感（图6e、6f）。在一个HER2阳性乳腺癌病例中，MTSs预测“EC-THP方案”效果最佳（图6g），而患者后续MRI检查也证实肿瘤显著缩小，达到病理完全缓解。更令人兴奋的是，这一平台还能够用于免疫治疗研究。研究团队将患者来源的MTSs与PBMC或CD8+ T细胞共培养（图6h），发现免疫细胞能够明显杀伤肿瘤球（图6i、6j）。同时，加入PD-1抗体后，杀伤效果进一步增强（图6l、6m）。这说明，未来这一平台甚至有望成为免疫治疗方案筛选工具。

图6：MTS平台可用于快速个体化药敏测试及免疫治疗评估。

随后，研究团队进一步展示了一个真实患者案例（图7a）。他们从HER2阳性乳腺癌患者获取组织，构建MTSs并进行药敏测试（图7b-7f）。结果显示，EC-THP方案最有效（图7g）。随后，小鼠移植实验进一步验证了这一结果：接受EC-THP治疗的小鼠肿瘤最小（图7h-7j）。更关键的是，患者本人接受相同方案治疗127天后，MRI结果显示原本巨大的肿瘤几乎完全消失（图7l），达到病理完全缓解。这意味着，MTS平台不仅能预测体外药物敏感性，还能真实反映患者临床结局。

图7：真实HER2阳性乳腺癌患者案例验证MTS平台的药物预测能力。

最后，研究团队在16位接受新辅助治疗的乳腺癌患者中验证了MTS平台（图8a）。研究人员在患者治疗前完成MTS药敏测试，并与后续真实疗效进行对比（图8b-8g）。结果显示，MTSs对患者治疗结局预测准确率达到93.8%（图8h）。其中，一位TNBC患者的MTS测试显示EC-T方案效果较差，最终患者实际疗效也仅为稳定疾病（SD）；而另一位Luminal B患者的MTS测试则预测其对ET-H方案高度敏感，患者随后确实获得显著肿瘤缩小。这种高度一致性表明，MTS平台具备极强临床转化潜力。

图8：MTSs对乳腺癌患者新辅助治疗结局的预测准确率高达93.8%

小结

总体来看，这项研究构建了一种高通量、快速且高度稳定的癌症干细胞培养平台。它不仅解决了长期困扰精准医疗领域的CSC分离难题，还首次实现了基于患者来源CSC的快速个体化药敏测试。相比传统类器官模型，MTSs在均一性、速度和临床预测能力方面都展现出明显优势。未来，随着更多癌种验证以及免疫治疗模块的完善，这种微孔芯片平台有望成为精准肿瘤医学的重要基础工具，让“先试药、再治疗”的真正个体化医疗逐渐成为现实。

原文链接：

https://www.stemcellsciencenews.com/newsletter/247206/