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背景介绍

基于循环游离DNA（cfDNA）的液体活检，尤其是循环肿瘤DNA（ctDNA）分析，已成为癌症诊断、预后和疾病监测的重要无创手段。其中，检测ctDNA中低频体细胞突变（通常变异等位基因频率VAF远低于1%）是精准肿瘤学的核心需求之一。然而，血浆DNA在样本采集、储存和运输过程中易受紫外线、温度波动、氧化应激和核酸酶等因素影响而发生降解，导致片段化、序列改变和遗传信息丢失，严重降低了稀有突变检测的灵敏度和准确性。因此，亟需开发能够在常温下保持cfDNA/ctDNA结构完整性和序列保真度的稳健保存策略，以摆脱对冷链物流的依赖并提高下游分子分析的可靠性。

研究思路

针对上述挑战，上海交通大学宋萍研究员、齐鲁工业大学胡琼政研究员与同济大学张云芳教授团队提出了一种基于ZIF-67金属有机框架的DNA保护策略。ZIF-67由Co²⁺节点和2-甲基咪唑连接体组成，其带正电的框架可与DNA带负电的磷酸骨架产生静电相互作用，同时咪唑配体与核苷碱基之间的π-π堆积进一步增强了DNA的亲和力和稳定性。研究通过材料表征、光谱分析和分子动力学模拟证实，ZIF-67通过协同静电吸附和π-π堆积作用实现DNA的高效包封，显著抵抗紫外线辐照、酶切消化和氧化应激造成的降解。更重要的是，该平台与阻断剂置换扩增技术完全兼容，可在室温保存四周后可靠检测VAF低至0.37%的稀有突变。在结直肠癌临床样本中验证了该策略的有效性，提供了一种无需冷链物流的可规模化材料解决方案。相关内容以 "Metal-Organic Framework-Enabled Protection of Plasma DNA for Long-Term Storage and Rare Mutation Detection" 发表在 《Advanced Functional Materials》！

图片解析

图1. ZIF-67合成及其在cfDNA保护和结直肠癌诊断中应用示意图： 展示ZIF-67从2-甲基咪唑和Co²⁺前体组装、捕获cfDNA、抵御外界损伤、EDTA释放DNA及下游BDA检测的整体流程。

图2. ZIF-67表征及其与DNA的相互作用： (a) ZIF-67逐步组装示意图。(b-c) SEM显示ZIF-67呈均匀多面体形态，粒径约1.5 μm。(d) XRD证实与标准ZIF-67图谱高度吻合。(e) SEM-EDS元素映射显示DNA加载后磷信号均匀分布于ZIF-67表面。(f) P/Co质量比从0.36升至0.51，证实DNA吸附。(g) 分子相互作用模型：静电吸引、偶极相互作用和π-π堆积协同介导DNA结合。(h) MD模拟快照（0、15、50、100 ns）展示DNA片段逐步吸附于ZIF-67表面。(i) DNA与ZIF-67表面最小距离随时间变化曲线，稳定低于0.5 nm。

图3. ZIF-67介导的DNA保护效率评估： (a) 实验流程示意图。(b) qPCR显示DNA吸附后上清中拷贝数降至背景值，EDTA释放后恢复至~6000拷贝。(c) EDTA浓度梯度热图显示500 mM EDTA可实现近100%释放效率。(d) 释放动力学显示10小时达平台期。(e) 琼脂糖凝胶电泳证实吸附-释放循环后DNA三种构象（超螺旋、开环、线状）完整恢复。(f-h) UV照射、DNase I消化和ROS氧化处理后，ZIF-67保护组DNA完整性保留60%-80%， unprotected组低于10%。(i-k) 室温储存四周后，ZIF-67保护组DNA完整性保持85%以上， unprotected组低于20%。

图4. ZIF-67保护与BDA富集整合用于稀有突变检测： (a) 含不同VAF的cfDNA经ZIF-67吸附保护、EDTA释放后行BDA分析示意图。(b) 保护前后标准曲线均呈现优异log-线性关系（R²均>0.97）。(c) 理论VAF与实测VAF在全动态范围内高度一致，贴近理想线。(d) 1% VAF样品BDA扩增产物Sanger测序清晰显示目标突变峰（A>C，rs2043583）。

图5. ZIF-67在临床血浆样本cfDNA保存和ctDNA突变检测中应用： (a) 临床工作流程示意图。(b) 18例健康供体cfDNA吸附前与释放后拷贝数高度相关，证实高效捕获与非破坏性释放。(c) 气泡图显示吸附后上清中cfDNA几乎检测不到，释放后恢复。(d) 4例结直肠癌患者KRAS变异VAF在ZIF-67保护前后保持一致。(e) 10例健康供体（均低于0.43%阈值）与6例结直肠癌患者（4例阳性）VAF检测对比。(f) 小提琴图显示患者组VAF分布更宽更高。(g) 代表性患者BDA产物Sanger测序确认KRAS G12X位点C>A杂合突变。

结论

本研究建立了基于ZIF-67的血浆cfDNA（含ctDNA）常温保存平台，用于长期储存和稀有突变分析。机制研究表明，保护作用源于带正电框架与DNA磷酸骨架间的静电吸引以及芳香配体与核苷碱基间的π-π堆积协同作用。这种双重物理化学稳定化策略有效抑制了紫外线、酶切和氧化应激造成的降解，在室温下保存四周后保持超过85%的结构完整性，无需依赖冷链。重要的是，该策略通过与BDA技术无缝整合，实现了低至0.37% VAF的ctDNA突变可靠检测。在18例健康供体和6例结直肠癌患者的独立临床队列中，所有健康对照均低于0.43%阈值，而4/6癌症样本检测出KRAS突变阳性，Sanger测序证实了C>A杂合突变。该工作将分子水平的物理化学稳定与临床相关检测结果直接关联，为缓解预分析变异、确保高保真稀有变异检测提供了一种可推广、无需冷链的策略。

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