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背景介绍

骨关节炎是老年人致残的主要原因，全球超过6700万人受其影响。目前OA的发病机制尚不清楚，现有治疗主要局限于症状缓解，终末期患者最终需要全关节置换。间充质干细胞在OA治疗中展现出潜力，但其有益效应主要归因于其分泌的胞外囊泡，其中凋亡囊泡（apoVs）因产量大、制备简便、富含磷脂酰丝氨酸便于靶细胞识别吞噬等优势，在临床转化中更具前景。然而，apoVs在关节腔中滞留时间短、缺乏细胞特异性靶向能力，严重限制了其临床应用。

研究思路

针对上述挑战，北京大学口腔医院的周永胜教授、张晓研究员以及上海交通大学医学院的林丹教授团队通过席夫碱反应将软骨细胞特异性适配体tgg2与骨髓间充质干细胞来源的apoVs共价偶联，获得tgg2@apoVs，并将其包埋于可注射的甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶中，构建缓释递送系统。tgg2@apoVs通过tgg2与软骨细胞表面FGFR1的特异性结合，显著增强apoVs的细胞摄取和软骨穿透深度，并避免溶酶体快速降解。该缓释系统在SD大鼠前交叉韧带横断OA模型中有效缓解OA症状，促进软骨细胞外基质合成，恢复线粒体氧化磷酸化功能。机制上，apoVs激活转录因子YY1，上调电子传递链复合物IV关键亚基Cox7c的表达，从而增强线粒体OXPHOS，减少线粒体活性氧产生。相关内容以Aptamer-functionalized apoptotic vesicles ameliorate osteoarthritis via resuming mitochondria OXPHOS of chondrocytes发表在Science Advances！

图片解析

图1. tgg2@apoVs缓释系统的构建及其靶向治疗OA示意图： tgg2@apoVs通过靶向软骨细胞并恢复线粒体OXPHOS改善OA。

图2. tgg2@apoVs的制备与表征： (a) tgg2溶液梯度浓度的UV吸收光谱。(b) tgg2浓度与OD值的线性关系（OD-260 nm）。(c-d) tgg2的碱基配对概率及预测的二级结构（三个茎环）。(e) 通过席夫碱反应制备tgg2@apoVs的路线示意图。(f) Zeta电位：tgg2@apoVs膜电位降低（n=6，**P<0.01）。(g) 琼脂糖凝胶电泳：tgg2@apoVs在43 bp处显示条带，证实成功偶联。(h) 粒径分布：apoVs和tgg2@apoVs平均尺寸约240 nm。(i) TEM：偶联前后形态无明显变化。(j) 流式细胞术定量：tgg2与apoVs的偶联效率约95%。(k) CCK-8：tgg2@apoVs在150 ng/mL时促进软骨细胞增殖，≥200 ng/mL时抑制。

图3. tgg2靶向软骨细胞并增强apoVs摄取： (a) 分子对接：tgg2与大鼠FGFR1结合自由能-25.0 kcal/mol。(b) 流式细胞术：tgg2Cy3特异性结合大鼠和小鼠软骨细胞，不结合rBMSCs和Raw264.7。(c) CLSM：tgg2Cy3与软骨细胞结合呈强红色荧光，Random-Cy3无信号。(d) Z-stack 3D图像及共定位分析：tgg2@apoVsPKH67与LAMP1（溶酶体）Pearson相关系数<0.5，而apoVsPKH67与LAMP1高度共定位（r>0.8）。(e) 大鼠软骨外植体穿透实验：tgg2@apoVs在48小时穿透全层软骨。(f-g) 穿透深度定量：tgg2@apoVs接近200 μm，显著深于apoVs和Random@apoVs（约150 μm）。(h) IVIS成像：HAMA+tgg2@apoVs在关节腔内滞留长达14天，远超无水凝胶组（约3天）。

图4. tgg2@apoVs增强关节软骨细胞ECM合成： (a) qRT-PCR：tgg2@apoVs组Col2a1、TGF-β、SOX9、COMP上调，IL-1β和MMP-13下调（n=3）。(b) 免疫荧光：tgg2@apoVs组Col2a1荧光增强，MMP-13减弱。(c) Western blot及定量：tgg2@apoVs组Col2a1升高、MMP-13降低（n=3）。(d-e) 甲苯胺蓝和阿尔新蓝染色：tgg2@apoVs组ECM染色最深。(f) Transwell迁移实验：tgg2@apoVs组迁移细胞最多。(g) 划痕愈合实验：tgg2@apoVs组愈合最快。

图5. tgg2@apoVs恢复OA软骨细胞线粒体OXPHOS： (a) CLSM：tgg2@apoVs组线粒体ROS（MitoSOX）最低。(b) 流式定量：tgg2@apoVs组ROS水平最低。(c) TEM：TNF-α组线粒体肿胀、嵴断裂，tgg2@apoVs组线粒体形态正常。(d) JC-1：tgg2@apoVs组线粒体膜电位恢复。(e) Cox7c免疫荧光：tgg2@apoVs组Cox7c表达最高。(f) Seahorse OCR：tgg2@apoVs组基础呼吸、最大呼吸显著恢复，质子泄漏减少。(g) ECAR：tgg2@apoVs对糖酵解无显著影响。

图6. HAMA+tgg2@apoVs可注射水凝胶的表征： (a) UV固化前后HAMA、HAMA+apoVs、HAMA+tgg2@apoVs宏观照片。(b) EDS：HAMA+tgg2@apoVs中P元素比例升至2%，证实核酸适配体存在。(c) FTIR：HAMA+tgg2@apoVs在1640 cm⁻¹出现席夫碱-C=N-特征峰。(d) XRD：apoVs或tgg2@apoVs不影响HAMA网络结构。(e) CLSM：tgg2@apoVs在HAMA中均匀分布。(f) SEM：tgg2@apoVs（红色箭头）均匀分布于水凝胶孔隙中。(g) 溶胀率：HAMA+tgg2@apoVs约8%，6小时达平衡。(h) 降解率：14天降解约75%。(i-j) 释放曲线：tgg2@apoVs呈双相释放（3天内突释，随后缓释），14天累积释放约90%。

图7. HAMA+tgg2@apoVs可注射水凝胶改善SD大鼠膝关节OA： (a) 股骨远端关节面照片：OA组骨赘形成和关节面侵蚀，HAMA+tgg2@apoVs组关节面光滑。(b) Micro-CT 3D重建及矢状面图像：OA组关节腔内游离骨软骨碎片（红色箭头）和软骨层囊性变（红色圆圈）。(c) 骨参数定量：HAMA+tgg2@apoVs组BMD、BV/TV、Tn.Tb、Th.Tb显著改善，Ts.Tb和BS/BV降低（n=5）。

图8. HAMA+tgg2@apoVs改善SD大鼠膝关节OA（组织学）： (a) H&E和甲苯胺蓝染色：OA组软骨层变薄、蛋白聚糖丢失、软骨细胞缺失，HAMA+tgg2@apoVs组细胞排列规则、纤维化减少。(b) 番红O-固绿染色。(c) H&E组织病理学评分热图。(d) OARSI评分标准。(e) OARSI评分：HAMA+tgg2@apoVs组显著降低（n=3）。(f) GAG含量定量：HAMA+tgg2@apoVs组GAG含量最高（n=3）。

图9. apoVs通过上调Cox7c改善膝关节OA： (a) KEGG富集：apoVs显著增强OXPHOS通路（蓝色框）。(b) 27个OXPHOS相关基因在ETC复合物I、II、IV、V中的分布气泡图。(c) qRT-PCR验证：apoVs显著上调Cox7c（P<0.01），Atp5pf和Ndufa13变化不显著。(d) Cox7c在复合物IV中的结构模型。(e) Cox7c敲低后线粒体形态：Cox7c siRNA组线粒体碎片化，apoVs或tgg2@apoVs恢复短棒状形态。(f) 线粒体分支数、分支长度和长宽比定量。(g) Western blot及定量：Cox7c敲低促进Cyt C释放，apoVs或tgg2@apoVs可逆转。(h) 六孔板细胞照片。(i-j) 细胞内乳酸和ATP水平：Cox7c敲低后乳酸升高、ATP降低，apoVs或tgg2@apoVs逆转。(k) 复合物IV活性：Cox7c敲低后活性降低，apoVs或tgg2@apoVs恢复。(l) tgg2@apoVs通过上调Cox7c恢复线粒体OXPHOS的机制示意图。

结论

本研究成功构建了适配体tgg2功能化凋亡囊泡的缓释递送系统（HAMA+tgg2@apoVs），用于OA靶向治疗。该系统通过tgg2与软骨细胞表面FGFR1的特异性结合，显著增强了apoVs的细胞摄取效率和软骨穿透深度，并避免了溶酶体快速降解。在ACLT诱导的SD大鼠OA模型中，HAMA+tgg2@apoVs有效缓解了OA症状，促进了ECM合成，恢复了线粒体OXPHOS功能。机制上，apoVs激活转录因子YY1，上调ETC复合物IV关键亚基Cox7c的表达，增强电子传递效率，恢复线粒体能量代谢，减少mtROS产生。该研究为OA治疗提供了靶向软骨细胞递送apoVs的新策略，并为基于能量代谢调控的EVs治疗提供了新思路。

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