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【论著】

本研究通过生物信息学与动物实验分析，对机械通气相关性肺损伤（VILI）中自噬通量的变化及其机制进行深入探讨，旨在证实VILI中存在自噬通量障碍的现象并筛选潜在靶点，为干预VILI提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1　生物信息学分析

1.1.1　数据集来源

从基因表达综合数据库（GEO）中下载数据集GSE11434，从小鼠基因组信息数据库和人类自噬数据库（HADb）中获得695个自噬相关基因（ARGs）。GSE11434芯片数据集基于GPL1261平台,该数据集的样本来源于10只小鼠：其中5只为大潮气量通气组，以20 ml/kg呼吸机通气3 h构建VILI模型；另外5只为非通气组，自主呼吸3 h。干预结束后，原研究者取上述10只小鼠的肺组织，基于Affymetrix 430 2.0 阵列平台进行了全基因组信使RNA（mRNA）表达谱测序，本研究从中获取了该测序数据用于后续分析。

1.1.2　差异表达基因（DEGs）的筛选

使用R软件（4.2.1）版本的Limma包，筛选VILI组（对应原数据集大潮气量通气组）与对照组（Con组，对应原数据集非通气组）小鼠肺组织中的DEGs。在P<0.05和|log2FC|≥0.58的条件下筛选DEGs，log2FC>0的DEGs被认为上调，而log2FC<0的DEGs被认为下调。用R软件的ggplot2［3.4.4］包绘制主成分分析（PCA）图，以评估组内样本的生物学重复性及组间的差异性；用ggplot2［3.4.4］包绘制箱线图，通过观察各样本基因表达量的分布中位线，评估样本间的一致性；用ggplot2［3.4.4］包绘制火山图，以直观展示DEGs的整体分布及差异情况；利用ComplexHeatmap［2.13.1］包绘制聚类热图，用于评估组内样本的表达一致性及组间的差异模式。

1.1.3　自噬相关差异表达基因（DEARGs）的识别

分别将上调的DEGs和下调的DEGs与695个ARGs进行交集分析，并利用ggplot2［3.4.4］和VennDiagram［1.7.3］包绘制韦恩图，以识别VILI相关的DEARGs。利用ComplexHeatmap［2.13.1］包绘制聚类热图，分析DEARGs的相对表达模式。

1.1.4　DEARGs功能富集分析

利用R软件的clusterProfiler［4.4.4］包对DEARGs进行功能富集分析，包括基因本体论（GO）术语和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路。GO功能富集分析包括细胞成分（CC）、生物过程（BP）和分子功能，并使用R软件的ggplot2［3.4.4］包进行可视化分析。

1.1.5　DEARGs的蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络构建

利用STRING数据库（https://string‑db.org/）构建DEARGs的PPI网络，使用Cytoscape v3.9.1软件进行可视化分析，最后通过CytoHubba插件筛选10个关键DEARGs。

1.2　动物实验分析

1.2.1　实验动物

选用8~12周龄的无特定病原体级健康C57BL/6雄性小鼠共16只，饲养房间维持室温22 ℃~23 ℃，湿度恒定50%~70%，并应用光照模拟12 h/12 h的昼夜循环，保证适量的饮水和饲料供给。小鼠在建模前采用随机数字表法分为Con组和VILI组，每组8只。

1.2.2　VILI模型构建

两组小鼠实验前均禁食禁饮12 h，模型构建前使用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠（腹腔注射40 mg/kg），待小鼠无体动反应后固定小鼠，选用内径为0.5 mm的气管导管行气管插管，呼吸机参数调整如下：潮气量30 ml/kg，呼吸频率100次/min，吸呼比1∶2，呼气末正压0 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），吸入氧浓度0.21。VILI组小鼠插管后呼吸机连续通气4 h，Con组小鼠插管后自主呼吸4 h。

1.2.3　苏木精‑伊红（H‑E）染色评估肺组织病理学改变

通气结束，深度麻醉后处死小鼠，随后分离肺组织。将取出的肺组织用多聚甲醛固定，经脱水、浸蜡及包埋后制成切片。切片经脱蜡水化后，依次进行苏木精染色、分化、返蓝及伊红染色，最后脱水透明并用中性树胶封片。染色完成后，利用光学显微镜观察两组小鼠肺组织形态学改变，重点观察肺泡结构的完整性、肺泡壁厚度、是否存在炎性细胞浸润、支气管管壁是否规整、有无间质水肿以及充血等病理特征，以综合评估肺损伤程度。

1.2.4　酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肺组织炎症因子白细胞介素（IL）‑1β和肿瘤坏死因子（TNF）‑α的水平

按照IL‑1β和TNF‑α的ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪测定450 nm波长时各孔的光密度值。每组设定4个肺组织样品进行检测，每个样品设定3个复孔以确保数据可靠，最终根据标准曲线计算IL‑1β和TNF‑α的水平。

1.2.5　总RNA提取和逆转录‑实时荧光定量聚合酶链式反应（RT‑qPCR）

使用RNA提取试剂盒提取两组小鼠肺组织的总RNA，并用逆转录试剂盒反转录为互补脱氧核糖核酸，逆转录体系见表1。设计DEARGs、溶酶体标志物溶酶体相关膜蛋白1基因（lamp1）及内参基因β‑肌动蛋白（β‑actin）的特异性引物，由北京擎科生物科技股份有限公司合成，引物序列见表2。使用2×SYBR Green qPCR混合液进行RT‑qPCR。反应条件：95℃预变性30 s、95 ℃变性15 s、65 ℃退火延伸30 s，40个循环。RT‑qPCR反应体系见表3。反应结束后，分析荧光曲线和Ct值。以2−ΔΔCt法计算DEARGs及lamp1的mRNA在两组小鼠肺组织中的相对表达量。

1.2.6　免疫印迹法（WB）检测两组小鼠肺组织中螯合体1（p62/SQSTM1）及微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ的水平

为验证筛选出的关键基因sqstm1在蛋白水平的表达及其与自噬过程的关系，本研究采用WB检测了p62/SQSTM1及自噬标志物LC3B的表达。两组小鼠肺组织剪碎后加入蛋白酶抑制剂和裂解液，低温研磨裂解后离心收集上清液。采用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定两组小鼠各样品的总蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，于95 ℃煮沸5 min使蛋白充分变性。将蛋白样品在电泳装置中进行十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，转移至聚偏二氟乙烯膜。室温下封闭15 min，随后加入p62/SQSTM1、LC3B和β‑actin一抗于4 ℃孵育过夜，洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温下孵育2 h。经含吐温‑20的Tris缓冲盐溶液洗膜10 min×3次后加入化学发光液在暗室条件下显影。通过图像分析软件计算目的蛋白条带灰度值。以目的蛋白p62/SQSTM1与内参蛋白β‑actin的灰度值比值表示p62/SQSTM1的水平；同时，通过计算LC3B‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ以评估两组小鼠肺组织自噬通量的变化。

1.2.7　透射电镜（TEM）观察肺组织中自噬溶酶体改变

用手术刀在培养皿的固定液中将两组小鼠的肺组织切取为1 mm×3 mm的薄片状组织块，厚度尽量控制在1 mm以内，整个过程在1~3 min 内完成，将小组织块离体取下后立即投入预备的装有电镜固定液的培养皿内。将两组小鼠肺组织块置于预冷的2.5%戊二醛溶液中，并在4 ℃下固定24 h，磷酸盐缓冲液漂洗后锇酸固定，脱水、包埋、切片、铀铅双染色后，TEM下观察两组小鼠肺组织中自噬溶酶体变化。

1.2.8　免疫荧光染色检测LC3B与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的表达水平及共定位情况

两组小鼠肺组织切片经脱蜡、水化及抗原修复后，使用血清封闭后分别加入抗LC3B和抗LAMP1一抗，于4 ℃孵育过夜。次日洗涤后，加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗和三甲川菁标记的羊抗鼠二抗以分别结合LAMP1与LC3B，避光孵育。细胞核以4'，6‑二脒基‑2‑苯基吲哚复染。封片后在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。采用Image J软件测量所取视野内LC3B和LAMP1的平均荧光强度，以定量分析其表达水平；通过LC3B和LAMP1双阳性细胞比例评估共定位情况，以反映两组小鼠肺组织中自噬体与溶酶体的融合效率。以上分析由不知分组的实验人员完成。

2 结 果

2.1　DEGs的筛选

PCA图显示，组内样本聚类良好，组间样本显著分离（图1Ⓐ）。归一化后的箱线图显示各样本中位线分布一致（图1Ⓑ）。火山图显示，共筛选出1 780个DEGs，其中上调的DEGs 944个，下调的DEGs 836个（图1Ⓒ）。聚类热图提示同组内样本的表达高度一致，且组间区分度极大（图1Ⓓ），验证了筛选出的DEGs能够准确代表VILI的病理特征。[<TPL:H:\office\BaiduSyncdisk\杂志\杂志\小样\20265\重拍后飞翔（论著）

2.2　VILI中DEARGs的识别

韦恩图结果显示，1 780个DEGs与695个小鼠ARGs进行交集分析后获得58个DEARGs，其中上调基因有27个（图2Ⓐ），下调基因31个（图2Ⓑ）。聚类热图表明，同组内各样本的基因表达趋势基本一致，而两组之间则呈现出不同的空间分布与表达模式（图2Ⓒ）。

2.3　DEARGs的功能富集分析

2.4　PPI网络构建和关键DEARGs的识别

DEARGs的原始PPI网络见图4Ⓐ，对PPI网络的分析见图4Ⓑ，筛选出的10个关键DEARGs见图4Ⓒ。10个关键DEARGs包括stat3、hspa5、ccl2、sqstm1、myc、egfr、tlr2、mcl1、cxcr4和hspa8，均为上调基因。

2.5　两组小鼠肺组织H‑E染色结果及炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平

Con组小鼠肺组织H‑E染色切片显示，肺泡结构清晰完整，肺泡壁薄且均匀，无明显渗出物及炎症细胞浸润；各级支气管管壁规整，无明显增厚及破坏；肺间质无水肿、充血表现（图5Ⓐ）。VILI组小鼠的肺组织H‑E染色呈现出肺泡结构紊乱，部分肺泡出现塌陷、融合，肺泡壁明显增厚，可见大量炎症细胞浸润，肺泡腔内有红细胞；支气管管壁也出现不同程度的增厚；肺间质可见明显的充血、水肿（图5Ⓑ）。

ELISA结果提示，与Con组比较，VILI组小鼠肺组织IL‑1β与TNF‑α水平显著升高（均P<0.05，图5Ⓒ、Ⓓ）。

2.6　两组小鼠肺组织DEARGs与lamp1的mRNA相对表达量比较

与Con组比较，10个关键DEARGs中，sqstm1、ccl2、cxcr4、hspa5、hspa8、myc、stat3、tlr2的mRNA相对表达量在VILI组小鼠肺组织中均明显升高（均P<0.05，图6）。与Con组比较，lamp1的mRNA相对表达量在VILI组小鼠肺组织中显著降低（P<0.05，图7）。

2.7　两组小鼠WB及TEM检测结果比较

WB结果显示，与Con组比较，VILI组小鼠肺组织p62/SQSTM1水平显著升高（P<0.05），同时LC3B‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ亦升高（P<0.05）（图8Ⓐ~Ⓒ）。TEM结果显示，Con组小鼠肺组织中可见数量及形态正常的自噬溶酶体，而VILI组小鼠肺组织中几乎未见自噬溶酶体（图8Ⓓ）。

2.8　两组小鼠肺组织LC3B和LAMP1表达水平比较与共定位分析

与Con组比较，VILI组小鼠肺组织中LC3B荧光强度明显增强（P<0.05），同时LAMP1荧光强度明显减弱（P<0.05，图9Ⓐ~Ⓒ）。LC3B与LAMP1的共定位结果表明，与Con组比较，VILI组小鼠肺组织中LC3B和LAMP1双阳性细胞比例显著减少（P<0.05，图9Ⓓ）。

3 讨 论

本研究利用生物信息学分析筛选DEARGs并构建动物模型，在VILI小鼠模型中观察到肺组织发生显著的病理损伤，伴随炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平的显著升高；RT‑qPCR结果显示，与Con组小鼠比较，sqstm1、ccl2、cxcr4、hspa5、hspa8、myc、stat3及tlr2的mRNA相对表达量在VILI组小鼠肺组织中显著升高；为进一步验证筛选出的关键基因sqstm1在蛋白水平的表达及其与自噬过程的关系，本研究采用WB检测了p62/SQSTM1及自噬标志物LC3B的表达，结果显示，与Con组小鼠比较，VILI组小鼠肺组织p62/SQSTM1水平显著增加，且LC3B‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ呈现升高趋势；TEM结果显示，Con组小鼠肺组织中可见数量及形态正常的自噬溶酶体，而VILI组小鼠肺组织中几乎未见自噬溶酶体；为明确自噬体与溶酶体融合异常在VILI自噬通量障碍中的作用，本研究利用RT‑qPCR检测了两组小鼠肺组织中溶酶体标志物lamp1的mRNA相对表达量，结果提示，与Con组比较，VILI组小鼠肺组织中溶酶体标志物lamp1的mRNA相对表达量显著降低；免疫荧光染色结果表明VILI组小鼠肺组织中LC3B平均荧光强度显著增强，LAMP1平均荧光强度显著减弱，且LC3B和LAMP1双阳性细胞比例显著减少，提示VILI组小鼠肺组织中自噬体与溶酶体融合异常，符合自噬通量障碍的特征。这些结果提示自噬通量障碍可能为VILI的重要病理环节。

本研究关注到，在自噬状态的动态评估中，单一指标的升高往往具有多义性。本研究观察到LC3B‑Ⅱ/LC3B‑Ⅰ与p62/SQSTM1水平呈现同步升高的特征。本研究利用TEM在超微结构水平进一步验证了这一推测，结果显示，VILI组小鼠肺组织中几乎未见自噬溶酶体。考虑到自噬体作为中间产物，其半衰期极短（仅10~20 min），在静态断面中捕捉到典型双膜自噬体的概率相对较小；相比之下，作为降解场所的自噬溶酶体若发生缺失，则是自噬体与溶酶体融合障碍的强有力间接证据。本研究观察到的自噬溶酶体显著减少与p62/SQSTM1水平升高互为验证，共同揭示了自噬通量障碍可能是VILI发生过程中的核心病理特征。RT‑qPCR结果提示VILI组小鼠肺组织lamp1的mRNA相对表达量较Con组显著降低；免疫荧光染色结果显示，与Con组比较，VILI组小鼠肺组织中LC3B平均荧光强度显著增强，LAMP1平均荧光强度显著减弱，并伴随LC3B和LAMP1双阳性细胞比例显著减少。这些结果提示VILI小鼠肺组织不仅存在自噬体的病理性积累，还伴随溶酶体功能受损，从而导致自噬体与溶酶体的融合过程障碍。这从细胞生物学角度进一步解释了前述p62/SQSTM1蓄积的原因：即由于融合环节的障碍，导致自噬体无法转化为自噬溶酶体进行最终降解。

对于DEARGs的功能富集分析，从GO功能富集分析结果看，BP主要聚焦于“自噬、利用自噬机制的过程、自噬的调节等”，CC主要定位于“自噬体、胞质区、分子伴侣复合体等”，揭示了DEARGs在介导自噬体形成、溶酶体降解及蛋白质稳态维持中的关键作用。KEGG通路富集分析结果虽以感染和免疫相关通路为主，但这些通路正是自噬‑炎症轴的重要上游，“麻疹、乙肝与巨细胞病毒”均可诱导并重塑自噬过程，其可通过与曲螺旋肌球蛋白样BCL2相互作用蛋白1特异性结合，从而阻断自噬末端融合阶段来增加复制。IL‑17信号通路作为中性粒细胞主导炎症的关键驱动，也可使自噬过程失调，从而形成“细胞因子‑自噬‑炎症”的调控机制；功能富集条目“脂质和动脉粥样硬化”则提示了巨噬细胞自噬溶酶体的形成与炎症小体调控的关联，提示激活该轴可抑制炎症。此外，“脂质和动脉粥样硬化”还提示了自噬‑溶酶体途径对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体的负向调控作用；结合本研究的发现，激活该调控轴可能成为抑制VILI炎症级联反应、减轻组织损伤的潜在策略。

本研究筛选并鉴定出8个与VILI发病及自噬调控密切相关的DEARGs。针对这些分子或通路在自噬过程中发挥的具体作用，后续可开展体外模型或在体实验进一步验证。

本研究中egfr与mcl1虽为DEARGs，但经RT‑qPCR验证未发现显著的差异表达，这可能是因为egfr和mcl1的表达变化发生在复氧后更晚的时间点，而本研究取材的时间不在其变化的峰值区间；也可能因其只在某些特定细胞类型中差异表达，所以在整体肺组织的分析中未能见到变化。

本研究后续还可通过转染单体红色荧光蛋白‑增强型绿色荧光蛋白‑LC3腺病毒的方法，并结合溶酶体抑制剂或融合阻断实验，以进一步精确分析自噬体与溶酶体融合障碍的分子细节。此外，本研究所用的通气参数（潮气量≈30 ml/kg，4 h）与数据集GSE11434中所用的通气参数（潮气量≈20 ml/kg，3 h）存在一定差异。通气参数的差异可能对自噬通量及基因表达产生一定影响，后续研究如果能统一通气参数，将更有利于机制验证。

国际麻醉学与复苏杂志,2026,47(05):398-409 .

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20250924‑00452

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